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CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望

更新时间:2009-7-31:  来源:毕业论文

CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望
CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统,为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识,特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较,从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解。
与其他表达系统相比,CHO表达系统具有以下的优点:
(1)具有准确的转录后修饰功能,表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子;

(2)既可贴壁生长,又可以悬浮培养,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力;

(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力,外源蛋白的整合稳定;

(4)具有产物胞外分泌功能,并且很少分泌自身的内源蛋白,便于下游产物分离纯化;

(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上,可以大规模生产。
 存在的问题
在过去的几十年里,人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发,取得了很大进展,但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求,目前上游工作中主要存在以下问题:
①构建的重组CHO细胞生产效率低,产物浓度亦低;

②某些糖基化表达产物不稳定,不易纯化;

③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节,主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达,而对高教表达的产物是否能有效地提取出来,即分离纯化过程考虑较少;

④重组细胞培养费用昂贵,自动化水平低下。
1.CHO细胞表达系统
       (1)优点
       CHO细胞属于成纤维细胞,既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来,为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性,动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM),但SFM往往导致细胞活力差,贴壁性差,分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”,无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素,细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比,CHO表达系统具有以下的优点:
       (1)具有准确的转录后修饰功能,表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子;
       (2)既可贴壁生长,又可以悬浮培养,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力;
       (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力,外源蛋白的整合稳定;
       (4)具有产物胞外分泌功能,并且很少分泌自身的内源蛋白,便于下游产物分离纯化;
       (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上,可以大规模生产。
(2)存在的问题
       在过去的几十年里,人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发,取得了很大进展,但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求,目前上游工作中主要存在以下问题:
       ①构建的重组CHO细胞生产效率低,产物浓度亦低;
       ②某些糖基化表达产物不稳定,不易纯化;
       ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节,主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达,而对高教表达的产物是否能有效地提取出来,即分离纯化过程考虑较少;
       ④重组细胞培养费用昂贵,自动化水平低下。

2.毕赤酵母细胞表达系统
       (1)特点
       自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年,已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种,且一年比一年多,与其它表达系统相比,毕赤酵母表达系统具有以下优势:
       1)含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子,用甲醇可严格地调控外源基因的表达;
       2)表达水平高,即可在胞内表达,又可分泌型表达。毕赤酵母中,报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l,一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列,使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中,有利于分离纯化;
       3)发酵工艺成熟,易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺,且细胞干重达100g/l以上,表达重组蛋白时,已成功放大到10000升;
       4)培养成本低,产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价,一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇,其余为无机盐,培养基中不含蛋白,有利于下游产品分离纯化;而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖;
       5)外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上,随染色体复制而复制,不易丢失;
       6)作为真核表达系统,毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构,具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
       (2)存在的问题
       尽管甲醇营养型酵母表达系统被认为是极具发展前景的真核表达系统,许多表达产物已用于临床治疗及预防,但它并不是万能的表达系统,作为一种新的表达系统,和其它表达系统一样,巴氏系统也并非尽如人意,同样有其局限性,仍然存在这样或那样的缺陷或不足。如分泌产物的不均一性,包括聚合体的存在,发酵周期较长,易污染,且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达;利用易燃的甲醇做原料,表达产物的卫生安全性需要考虑;筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限;低表达或不表达的例子也在增多。信号肽加工不完全,修饰功能欠完善以及内部降解等现象,给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难。而且,与安全可靠、背景清楚的酿酒酵母相比,巴氏系统还有其它缺点:
       (1)分子生物学的研究基础差,要对其进行遗传学改造困难较大。
       (2)不是一种食品微生物,发酵时又要添加甲醇, 所以,要用它来生产药品或食品还没有被广泛接受。
       (3)发酵虽然能达到很高的密度,但是发酵周期一般较长。
       其中最重要的一个缺陷就是分泌表达的蛋白在培养基中被自身分泌的蛋白酶降解,由于甲醇酵母多采用高密度发酵,蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高。
       下面三种方法可以在发酵过程中有效降低外源蛋白的降解:①添加富含氨基酸的添加剂,如:胰蛋白胨,它们可以作为蛋白酶的底物被分解而减少目的蛋白的降解;②改变培养基 pH值,由于毕赤酵母可以在pH值为3.0~7.0的范围内正常生长,调节 pH值可以改变蛋白酶的活性,从而减少蛋白质的降解;③应用蛋白酶缺陷型菌株,如:SMD1163、1165、1168。
       其次,有些蛋白在毕赤酵母中表达量很低或不表达,原因至今尚未完全阐明,但可能与以下几方面有关:
 ①毕赤酵母与人及其它物种一样对所使用的氨基酸密码子具有不同的偏好性,这可能限制其蛋白质翻译速度。比较 110种酵母基因密码子使用情况发现,所有基因可分为明显的两组:高表达组和低表达组。高表达组基因的密码子相应的tRNA也明显高于低表达组,第三位密码子为胞嘧啶的比例也明显升高,AT含量则比较低。鉴定酵母和人类使用频率最低的密码子发现:8个低频密码子中有6个是一样的,无论大肠杆菌,果蝇,还是酵母和人类,大量表达的蛋白基因中低频密码子则明显减少,低频密码子含量高的蛋白质大量表达都是对其自身有害的。为了在毕赤酵母中表达HIV-2外壳糖蛋白gpl05,Zhang YJ等将低频密码子AGG突变为同源的CGA,编码天冬氨酸的GAT突变为编码谷氨酸的 GAA,并引入了酵母偏好的TCC,最终实现了gpl05在其中的高表达;
       ②当整合拷贝数增多后,可能在转录水平产生后生(Epigenetic)的调节,影响重组蛋白产率的提高;
       ③转录提前终止,这主要是因为AT含量过多引起的。据报道HIV.1 gpl20就是因为在AT丰富区因转录提前终止而不能在毕赤酵母中表达,在酿酒酵母中有一些共有序列,类似于HIV-1gpl20中引起转录提前终止的AT丰富区域,如:TTTTATA,当改变这些序列后,就可发现更长的mRNA出现。
诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点,已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元,1997年超过60亿美元,年增长率达20%以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。

基因工程药物研究与开发的主要环节包括:①基因的克隆和基因工程菌的构造;②重组细胞的培养;③目的产物的分离纯化等。

针对这些主要环节,研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展,目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统,其显著优点是易于操作,产量高,成本低,但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解,因此它的药放大大降低。此外,它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系;因为与其他表达系统相比,它具有许多优点:

①具有准确的转录后修饰功能,表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子;

②具有产物胞外分越功能,便于下游产物分离纯化;

③具有重组基因的高效扩增和表达能力;

④具有贴壁生长特性,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力,可以进行悬浮培养,表达水平较高;

⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast),很少分泌自身的内源蛋白,利于外源蛋白的启分离。

但CHO细胞培养成本高,条件难掌握,易污染,在一定程度上影响了它的广泛应用。 目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2),其中部分药物已投放市场,倒如EPO、GCSF等。

CHO细胞属于成纤维细胞,既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来,为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性,动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM),但SFM往往导致细胞活力差,贴壁性差,分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”,无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素,细胞可在SFM中生长良好。

前景展望

在今后的若干年内,随着以CHO细胞为主的动物细胞表达系统日趋完善,动物细胞将可能成为生产基因工程药物的主要宿主细胞。围绕CHO细胞表达系统而进行的相关研究将成为生物工程领域一个活跃的研究热点。科研人员将把以下问题作为今后的主攻方向:

①提高表达水平,如发展一些新的强启动子,寻找合适的增强子,装配适合于cDNA高效表达的必要元件以及根据CHO细胞翻译特点调整外源基因密码子等;

②在进一步提高表达水平的同时.还将注重分离纯化的问题,如改变DNA中的个别序列,使表达产物在不影响生物 活性的前提下,携带有利于分离纯化的基团;

③细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化、自动化精巧化;

④分离纯化的低成本和高活性回收率。

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