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制造病毒性心肌炎动物模型毒株的比较

更新时间:2014-9-10:  来源:毕业论文

制造病毒性心肌炎动物模型毒株的比较
  【摘要】 目的 比较柯萨奇B3m株病毒(CVB3m)和柯萨奇B3o株病毒(CVB3o)在实验中引起小鼠心肌炎的发病情况,为心肌炎造模者提供客观的实验参考。方法 用CVB3m和CVB3o感染Balb/c实验小鼠,测定两株病毒在鼠心肌细胞中的滴度;用常规病理法观察两株病毒致小鼠心肌炎的情况。结果CVB3m和CVB3o感染组小鼠心肌病毒滴度的峰值出现的时间基本相同,CVB3m的滴度较高;CVB3m感染组小鼠死亡率明显高于 CVB3o,两株病毒致小鼠心肌炎的发病率分别为 76%和17%。结论 CVB3m和CVB3o致小鼠心肌炎的差异明显,在制造小鼠心肌炎模型时建议选择CVB3m。
  【关键词】 心肌炎; 疾病模型,动物; 柯萨奇病毒B组

The comparison of virus strains on establishing the murine viral myocarditis model

 CUI Xiaodai MA Lianhua XU Zheng et al.
Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

  【Abstract】 Objective To investigate the development mouse myocarditis induced with coxsackievirus B3m(CVB3m) and B3o(CVB3o) and provide references to researchers interesting in such murine model. MethodsCVB3m and CVB3o were used to infect Balb/c mice. The virus titer was detected in the mouse myocardium. The mouse myocarditis was diagnosed with the routine histopathological method. Results The peak titer of CVB3m in mouse myocardium was higher than that of CVB3o. The death rate of CVB3m infected mice was much higher than that of CVB3o. The incidences of CVB3m and CVB3o induced murine myocarditis were 76% and 17%, respectively. Conclusion There were obvious differences between CVB3m and CVB3o on inducing murine myocarditis. CVB3m was suggested to establish the murine myoocarditis model.
  【Key words】 Myocarditis; Disease models, aninal; Coxsackieviruses B

  小儿病毒性心肌炎的治疗一直是临床工作者非常关注的问题[1,2]。建立一个稳定和可靠的病毒性心肌炎的动物模型,对治疗心肌炎的药物筛选及药效研究是必不可缺少的[3,4]。我们对制造小鼠病毒性心肌炎动物模型较常用的柯萨奇B3两株病毒进行了比较,通过动物实验获得了一些客观实验数据,为心肌炎造模者提供了客观的实验参考资料。

材料和方法

一、毒株

  1.M株柯萨奇B3病毒(CVB3m,美国Voment大学Hubber教授惠赠)
  2.O株柯萨奇B3病毒(CVB3o,美国疾病控制中心提供)。
  3.病毒滴度:3×108PFU/ml,Hela细胞传代。

二、动物

  180只6~8周的Balb/c 雄性小鼠(中国医学科学院实验动物研究所提供,二级实验动物)。

三、实验操作

  1.实验分组:⑴实验1组:Balb/c小鼠20只,每只小鼠腹腔注射 0.5 ml 的3×103PFU/ml的CVB3o; ⑵实验2组: Balb/c 小鼠30只,每只小鼠腹腔注射 0.5 ml的 3×103PFU/ml的 CVB3m;⑶对照组:Balb/c小鼠10只,每只小鼠腹腔注射 0.5 ml的无血清Eagle's液。以上各组重复3次。
  2.动物实验:对各组动物的一般生活状况,活动、毛色、饮水、进食、排便和死亡等进行连续观察并作记录。在实验的第2、4、6 、8、和10天,解剖2~5只存活的实验组及对照组小鼠,并获取心脏、胰腺、肝脏等标本。
  3.病理:对获取的小鼠心肌、胰腺等标本作常规病理切片,光镜下进行病理诊断。
  4. 病毒滴度测定:心肌等组织标本,0.1 mol/L PBS洗2次,组织匀浆器将其破碎,离心 2 000 r/min,15 min,-70℃保存直到应用。采用国际通用的病毒滴定法——PFU法,对其病毒含量进行测定。

结果

一、各组小鼠心肌组织病毒滴度的测定

  小鼠感染CVB3o后第4天,心肌细胞内可检测到病毒存在,但滴度较低,第8天后心肌组织内几乎检测不到病毒的存在; CVB3m感染小鼠第4天至第10天测定心肌细胞内的病毒滴度,病毒滴度高峰出现在第6~8天,此时的病毒滴度明显高于CVB3o感染的小鼠。到第10天有少量标本病毒滴度仍为阳性(图1),对照组小鼠心肌病毒滴度均为阴性。

 


图1 CVB3m和CVB3o在鼠心肌中的滴度

二、各组小鼠死亡情况

  60只CVB3o感染组小鼠有9只在实验中自然死亡,死亡率为15%。而90只CVB3m感染组小鼠有66只自然死亡,死亡率为73%。正常对照组小鼠无一例死亡。

三、各组小鼠体征及心肌病理改变的情况

  CVB3o感染小鼠从第3天开始有个别小鼠有松毛、后肢瘫等表现,而拒食、稀便现象较为多见;常规病理检查显示从第6天开始有少数小鼠心肌有变性、炎症和坏死等病理改变,程度较轻,病灶小而散在。实验1组小鼠心肌病变发生率平均为17%。CVB3m感染组小鼠从第3天开始绝大多数有松毛、双后肢瘫、拒食和稀便等表现。病理检查显示从第4天开始小鼠心肌有变性、炎症、坏死、心包炎、钙化等病理改变,且多数小鼠心肌病变程度较重,部分小鼠心肌有弥漫性炎症、坏死出现(图2,3)。在实验2组小鼠心肌病理诊断中,76%的小鼠心肌有上述病理改变。对照组小鼠未见有任何病理改变。

讨论 CVB3m和CVB3o均为CVB3标准株(CVB3n)——Narcy株的变异株。对上述两株病毒的致病特性已有一些单独的报道[5,6]。但同时比较它们的致病特性的文章还比较少见。我们同时用两株病毒分别感染实验小鼠,然后进行了比较,获得了一些有参考价值http://www.lwfree.cn/的数据。
图2 CVB3o感染小鼠的心肌组织 可见较局限炎症坏死灶存在 HE染色 光镜 ×66
图3 CVB3m感染小鼠的心肌组织 可见弥漫炎症坏死灶存在 HE染色 光镜 ×66 结果显示,小鼠在感染CVB3m后,小鼠的死亡率、心肌病毒滴度和心肌炎发病率均明显高于CVB3o感染的小鼠,说明CVB3m亲小鼠心肌性较CVB3o高。提示在制造小鼠心肌炎模型时应选择CVB3m。
  一个可靠和稳定的动物模型是心肌炎发病机理、心肌炎治疗及药物筛选不可缺少的实验工具[7]。许多实验在造模时经常会遇到许多问题。大家普遍认为,动物的死亡率和心肌炎发病率比较难以控制。我们的实验表明,造模时毒株的选择是非常关键的。多数人都知道CVB3可用于制造小鼠病毒性心肌炎动物模型,但对CVB3的毒株了解较少。据了解目前国内至少有3株以上CVB的变异毒株,其来源不尽相同。这很可能是各个实验室造模时动物的发病率和死亡率不尽相同的一个重要原因。
  柯萨奇B组病毒的局部暴发流行,国内和国外近几年时有发生,似乎较10年前有增多的趋势,但每次流行时有关心肌炎发生率的报道差别很大[8,9]。我们认为这可能与毒株的不同存在着直接的关系,故在病毒的暴发流行时,获取标本,分离病毒,对毒株进行鉴定,将对心肌炎的预防及治疗有很大的帮助。
  有关柯萨奇B组病毒的变异情况,我们先前有过初步的报道[10]。我们认为在这方面有必要进一步深入研究。如在这方面取得突破,必将为病毒的致病特性、心肌炎的发病机理以及心肌炎的预防和治疗起十分积极的推动作用。

(本文编辑:滕淑英)

基金项目:北京市科技新星计划资助(951870700)
作者单位:崔小岱(100020 北京,首都儿科研究所     马连华(100020 北京,首都儿科研究所     许峥(100020 北京,首都儿科研究所     呼守生(100020 北京,首都儿科研究所     Ricardo Gomez(100020 北京,首都儿科研究所(100020 北京,首都儿科研究所    张霆(100020 北京,首都儿科研究所参考文献

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