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我国迪谢内肌营养不良分子遗传学研究概况

更新时间:2014-10-20:  来源:毕业论文

我国迪谢内肌营养不良分子遗传学研究概况
  迪谢内肌营养不良(DMD)是一种常见的致死性神经肌肉系统X连锁隐性遗传病,发病率为活产男婴的1/3 500。患者一般3~5岁发病,主要表现为全身骨骼肌进行性无力、萎缩和小腿腓肠肌假性肥大,随着病情加重,20岁左右因呼吸衰竭死亡,迄今无有效的治疗方法。1987年Kunkel等将该基因cDNA克隆,继之测序及确定其蛋白产物,为DMD的研究开创了新纪元。我国自1987年开始对DMD的分子遗传学进行了研究,在基因结构、基因产物的分析和基因诊断等方面取得了一定的成果,现简述如下。
  一、基因结构的研究
  1. 基因全顺序的人工酵母染色体(YAC)克隆:柴建华等[1]用DMD cDNA探针从YAC文库中筛选出5个YAC克隆,经用HindⅢ酶切和DNA印迹杂交分析,确定各YAC克隆相互部分重叠,并包含从5′至3′端基因的完整顺序,其基因组长度大约为2 500 kb。
  2. 大尺度限制性酶图谱研究:绘制了上述5个YAC克隆DNA的Mlu Ⅰ、Cla Ⅰ和Sfi Ⅰ酶切图谱[2]。在1~48号外显子1 380 kb的区域中,有7个Mlu Ⅰ 切点,3个Cla Ⅰ 切点。从5′到3′端,Mlu Ⅰ片段的排列是400 kb、240 kb、50 kb、280 kb、120 kb、80 kb,Cla Ⅰ片段的排列是250 kb、300 kb, Sfi Ⅰ的酶切图谱与国外报道的相似。余龙等[3]研究了抗肌萎缩蛋白基因3′端的分子结构,在该基因的3′末端发现了一个新的725 kb Sfi Ⅰ片段;用DMD cDNA9~14片段制备了16个相邻部分重叠的亚探针,系统地研究了该基因3′端Hind Ⅲ片段的数目和排序,证明了3′末端的Sfi Ⅰ/IJ片段至少含17个Hind Ⅲ片段或19个外显子。魏勇等[4]应用Alu-PCR指纹技术发现了两个YAC克隆构成了包含DXS166位点的重叠群,这一发现使得以上YAC重叠群至少延伸至DXS166位点,形成了1个跨度为3.5 Mb的YAC重叠群。
  3. 精细限制酶图谱及外显子的定位[5]:用DMD cDNA8探针,从人X染色体噬菌体文库中筛选出目的克隆。将该克隆DNA用Eco RⅠ、Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ部分酶切,λ噬菌体左右臂探针杂交,首次绘制抗肌萎缩蛋白基因在51外显子及其两侧的精细限制酶图谱。在13 kb的插入片段中,有3个Kpn切点,4个Eco RⅠ切点,5个Hind Ⅲ切点。根据Kpn Ⅰ酶切位点的位置,将51号外显子准确定位于3.1 kb Hind Ⅲ片段的中央。
  4. 50号和51号外显子的克隆和测序[6,7]:将该Hind Ⅲ片段经限制酶完全酶切后亚克隆于pUC118中, 所获得的亚克隆进行全序列测序。结果发现,50和51号内含子AT含量高达70%以上,呈聚集性分布,并存在有36个n为5~20的短串联重复序列,22个正向和反向重复序列,和8个同源序列。
  5. DNA缺失的可能机制[8]:根据50、51号内含子结构的以上特点,我们首次提出不同内含子中AT富集区的重复顺序与DNA缺失有关。为验证以上观点,分析了另一缺失热点(44号内含子)254 bp的序列特点,结果发现,该内含子AT含量为63.6%,与50号内含子和51号内含子均存在重复顺序,以上结果支持我们的观点。由于发生重组的同源顺序的位置,决定了缺失断裂点的部位,这就很好地解释了为什么缺失断裂点并不固定于某一特定的序列,为什么缺失范围大小不一。
  二、 基因诊断
  目前我国许多单位均已开展了基因诊断,进行DMD患者、携带者检测和产前诊断。最早开展此项工作的是曾溢滔,他在运用RFLPs和PCR技术作基因诊断方面做了大量的工作。其他如DNA印迹杂交、定量PCR、RT-PCR等基因诊断方法亦得到了开展。
  1. 患者的诊断:早期主要应用DNA印迹杂交法进行DMD基因诊断,该方法的检出率取决于所用的探针。以C7、87-15、87-30、87-8、87-1、X.J 1.1、X.J 2.3、J.Bir为探针可检出20%的DMD患者有缺失[9],cDNA1-2a、cDNA2b-3探针检出缺失率为20%[10],cDNA5b-7、8、9、10探针检出缺失率为48%[11],缺失主要集中在cDNA8探针所在部位。全序列cDNA探针检出缺失率为55%~65%。
  DNA印迹杂交法由于耗时长、技术要求高,限制了它的应用。随着PCR技术的成熟,很快PCR技术就成为了诊断DMD的主要手段。PCR技术简单、快速,尤其是多重PCR,为缺失型DMD/BMD患者的诊断提供了一种很好的手段。Chamberlain等设计的9对引物可检测出80%的缺失患者;Beggs等增设了另9对引物,这18对引物可检测出98%的缺失患者。18对引物多重PCR检测在国内报道不多,杨军等[12]用18对引物检测了17例DMD患者,结果9例有缺失。高文英等[13]以18对引物检测了37例DMD/BMD,检出缺失患者19例。我国由于条件限制,大部分研究均采用二步9对引物多重PCR检测DMD/BMD患者。汪江等[14]用9对引物检测了134例DMD/BMD患者,检测阳性率为49.3%。据我们对274例国内资料分析,我国9对引物多重PCR的总检出率为47%。其中5对引物(12、17、45、48、51号外显子)的总检出率为46%,占9对引物检出率的96%。
  对点突变的研究,由于DMD患者外显子多、点突变率低,国内仅王柠等[15]应用PCR-SSCP技术在17号外显子上发现1个由G向T的颠换。
  另外,RT-PCR用于诊断缺失[16]和定量DNA印迹杂交技术[11]用于诊断重复,国内亦见有文献报道。
  2. 携带者诊断: 最早主要是利用RFLP技术。曾溢滔等[9]以C7、87-15、87-30、87-8、87-1、X.J 1.1、X.J 2.3、J.Bir为探针发现95%携带者的RFLP是杂合的。陈凡等[17]利用754、pERT87-8、P20为探针在8个资料完整的DMD家系25名女性中确定11名为携带者。魏建军等[18]研究了9个DMD基因探针的多态频率,发现pERT87-7、X.J 2.3、X.J 1.1三探针组合可检出90%的女性出现多态位点。许顺斌等[19]利用PCR技术扩增5′和3′非翻译区两个CA重复序列,发现5′CA重复序列具有6种等位片段,频率为0.033~0.267,多态信息量(PIC) 0.75。3′CA重复序列有两种等位片段,频率为0.75、0.25,PIC 0.375。应用以上位点对非缺失型DMD家系进行连锁分析,诊断携带者1例。RFLP技术的优点是可对基因型不明确的DMD家系进行携带者和产前诊断,但存在以下缺点:(1) 技术难度相对较大,需要DNA样本量大,耗时长;(2) 虽然与PCR技术结合在一定程度上简化了RFLP技术,但RFLP技术需要完整的家系资料;(3) 有可能因染色体重组而造成误诊,由于抗肌萎缩蛋白基因的基因内重组率高达10%,因而其误诊率可能是不容忽视的。
  定量DNA印迹杂交亦能用于检测携带者,但同样由于耗时长、技术难度大,很难普及推广。
  我科于1996年开展直接定量PCR法检测缺失型DMD基因携带者,对4个缺失型DMD家系中的11名女性家属检测结果显示,6名女性为携带者[20]。直接定量PCR检测携带者敏感性高、快速、简便。但对照位点和缺失位点的引物之间不能有互相影响,首先必须确定对照位点和缺失位点扩增产物的产量在PCR对数扩增期是相等的或具有某一线性关系。
  3. 产前诊断: 国内主要采用RFLP和PCR方法进行产前诊断。曾溢滔等[9]利用RFLP技术成功确定1例胎儿为DMD患者,1例女性胎儿为携带者,结果经流产或分娩验证。高百红等[21]利用PCR技术扩增pERT87-15区域DNA,经Xmn Ⅰ酶切,发现5个家系中2个可行产前诊断和携带者诊断。通过取胎儿绒毛组织或妊娠中期羊水细胞制备DNA,经PCR检测能对先证者为缺失型DMD患者的胎儿进行产前诊断。华小云等[22]对10名DMD高危胎儿以多重PCR进行产前诊断,结果7名男性胎儿中有3例为DMD患儿,3名女性胎儿中有1例为携带者,以上结果经出生后复检证实。吴元清等[23]以14对引物多重PCR方法对6例先证者为缺失型的高危胎儿进行产前诊断,结果发现4例为DMD患者。
  三、 基因产物——抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的研究
  1. 抗肌萎缩蛋白的疏水结构[24]: 为了探讨DMD的发病机制,我们对抗肌萎缩蛋白进行了疏水性分析,首次发现在95~120,1 990~2010,2 438~2 493和3 150~3 300位氨基酸有疏水峰出现,其中第三个疏水峰的疏水性最强,位于缺失热区51外显子的编码区内,疏水氨基酸占54%,远较整个蛋白中疏水氨基酸的比例(26%)为高。
  2.疏水结构与DMD/BMD的关系[25]: 为验证缺失热区疏水结构的重要性,我们分析了65例整码缺失DMD和136例整码缺失BMD患者,发现75%的整码缺失DMD患者丢失该疏水肽段,98%的BMD患者保留有该疏水肽段,提示该疏水肽段是抗肌萎缩蛋白的一个重要功能区,它的存在与否直接影响疾病的预后。Monaco曾提出“移码突变”导致DMD,整码缺失导致BMD。这一假设已广为接受,并受到了许多研究的验证,但有8%的例外。我们的发现是对以上假设很好的补充。
  3. 蛋白的表达和抗体的制备: 抗肌萎缩蛋白基因的表达是DMD国际研究热点之一,对研究该蛋白的结构和功能,以及制备相应的抗体用于蛋白诊断均具有重要的意义。颜真等[26]将抗肌萎缩蛋白基因cDNA 5 824~7 007 bp基因片段,经测序验证后与载体pSM43连接,转化大肠杆菌TAP106,在国内首次获得了重组基因的高效表达菌株,成功地表达了分子量为49 000的DMD cDNA5-7蛋白。进一步将由以上方法制备的蛋白经纯化处理后免疫兔,得到了高效价的抗血清Anti5-7[27],为我国DMD/BMD的蛋白诊断创造了条件。
  四、 基因治疗
  DMD的基因治疗是近年来备受关注的前沿课题,在美国颇受重视,并得到大强度的资助。由于抗肌萎缩蛋白基因巨大,其cDNA序列长达14 kb,目前已经建立的载体系统都难以容纳该基因完整的cDNA片段,因此,为DMD/BMD的基因治疗造成了很大的困难。肌母细胞移植是近年来发展起来的技术,并曾在美国应用于临床,获得了一定的效果。但对此治疗效果争议颇大,部分研究发现肌母细胞移植后,经过一定的时间,移植入的肌母细胞几乎无一成活。
  我国在DMD的基因治疗方面起步较晚,目前开展此方面研究的单位不多。但可喜的是,近年已受到了许多学者的重视,相关的综述很多。现在我科正在进行新载体的研究,并拟开展肌母细胞移植工作。
  五、 存在问题和发展方向
  抗肌萎缩蛋白基因巨大,缺失率高,对该基因结构的研究有助于我们了解染色体重排的规律及对缺失机制的认识。我国在对抗肌萎缩蛋白的基因结构方面的研究取得了可喜的成绩,但对内含子序列的研究仍然不多。尤其是缺失患者断裂点局部序列的研究仍然是空白。另外,对抗肌萎缩蛋白及其相关蛋白(dystrophin-associated proteins)功能的研究亦是国际研究的热点之一。
  我国目前尚缺乏大规模的对中国人抗肌萎缩蛋白基因突变特点的研究。部分研究发现,抗肌萎缩蛋白基因突变有一定的种族特异性,如以色列、保加利亚、希腊DMD患者基因断裂点分布有一定的特点,日本DMD基因重复率明显高于西方人,我国亦发现部分位点具有特有的多态片段。这就提醒我们有必要对中国人的抗肌萎缩蛋白基因突变特点进行各单位协作的大规模研究,从而为我国开展更有针对性的检测提供依据。
  DMD的基因治疗在短期内很难有突破性的http://www.lwfree.cn发展,因而携带者的检测和产前诊断就显得尤为重要。直接定量PCR检测缺失型携带者方法简单、快速、准确、敏感性高,很适合普及推广。对基因型不明确的突变,目前主要用PCR-RFLP技术进行产前诊断。另外在产前诊断时,胎儿DNA样本的取材上仍需进一步研究,若能通过脐血或母血获得高纯度的DNA样本,则能使产前诊断更易于普及。另外,随着试管婴儿技术的推广,着床前的诊断将是我们面临的另一问题。
  基因治疗虽然难以取得突破,但它毕竟是治疗DMD的前途所在。在DMD基因治疗方面的研究,主要存在两大热点。一是新载体系统的建立,构建能携带抗肌萎缩蛋白基因完整的cDNA片段的新载体系统是DMD基因治疗的当务之急。二是虽然对肌母细胞移植的疗效有争议,但毕竟目前研究不多,如果能提高移植后肌母细胞的成活率,则肌母细胞移植应用于临床将为期不远。

作者单位:张成 潘速跃  刘焯霖  510080 广州,中山医科大学附属第一医院神经科

参考文献

 1 柴建华,顾杨洪,张成,等. DMD基因全顺序的YAC克隆. 科学通报,1992,37: 2004-2006.
 2 张成,柴建华,刘焯霖,等. 部分抗肌萎缩蛋白基因酵母人工染色体物理图谱. 中山医科大学学报, 1993,14:80.
 3 余龙,赵寿元. 中国人杜氏肌营养成不良基因3′端分子结构的初步研究. 中国科学*B辑, 1995,25:740-748.
 4 魏勇,蔡倜,吴晓晖,等. 人Xp21.1-p21.3上3.5 Mb YAC重叠群构建及物理图谱分析. 生物化学与生物物理学报, 1995,27:636-642.
 5 张成,柴建华,刘焯霖,等. 抗肌萎缩蛋白基因51号外显子的精确定位. 中山医科大学学报, 1993,4:19.
 6 张成,柴建华,刘焯霖,等. Dystrophin基因50和51号内含子的核苷酸顺序分析. 中华医学遗传学杂志, 1993,10:268-270.

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