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肠道微生物Akkermansia muciniphila的功能基因研究(3)

时间:2018-10-23 10:15来源:毕业论文
pCP20是温度敏感型的质粒,同时含有氨苄和卡那两种抗性基因。在42℃诱导时可编码翻转重组酶(Flipase Recombination Enzyme, FLP),FLP能够和pKD4上的FRT位点特异性


    pCP20是温度敏感型的质粒,同时含有氨苄和卡那两种抗性基因。在42℃诱导时可编码翻转重组酶(Flipase Recombination Enzyme, FLP),FLP能够和pKD4上的FRT位点特异性结合从而将卡那抗性基因和FRT位点消除。与此同时,pCP20由于对温度敏感也逐渐消失[17,18]。
    质粒pKD4、pKD46和pCP20都保存于E.coli DH5α中,在-80℃冰箱冻存。Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835是用于同源重组的菌株,购于德国微生物菌种保藏库。
1.2 试剂与仪器
    细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司;柱式质粒DNA小量抽提试剂盒 OMEGA Bio-Tek公司;卡那霉素、氨苄青霉素 Sigma-Aldrich公司;LB营养琼脂、脑心浸出液肉汤(BHI) 青岛高科园海博生物技术有限公司;Agar Powder 北京索莱宝科技有限公司;L-半胱氨酸盐酸盐无水物  上海麦克林生化科技有限公司;黏蛋白 上海源叶生物科技有限公司;引物 金斯瑞生物科技有限公司合成
高压灭菌锅 上海莱睿科学仪器有限公司;凝胶成像仪、电泳仪、电穿孔仪、0.1cm电极杯 Bio-Rad公司;基因扩增仪 Eppendorf公司;多功能酶标仪 美国MD公司;Nanodrop 2000 Thermo Scientific公司;厌氧微生物培养工作站 英国Ruskinn公司;高低温恒温培养箱 上海悦丰仪器仪表有限公司;恒温振荡培养箱 伊孚森生物技术(中国)有限公司;台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司;高速冷冻离心机 德国Beckman Coulter公司
1.3 A. muciniphila基本生长特性研究
1.3.1 生长曲线测定
从-80℃冰箱中取A. muciniphila菌种,按5%接种于BHI+0.2%mucin新鲜液体培养基中活化,酶标仪测定菌体OD600达到0.15左右时,再将菌液按5%的量分别接种于3瓶60mlBHI和3瓶60mlBHI+0.5%mucin新鲜液体培养基中,另外设置未接菌液的BHI和BHI+0.5%mucin培养基作为对照,每隔4h用酶标仪测OD600,总共72h,整理数据绘制生长曲线图。 源`自*六)维[论*文'网www.lwfree.cn
1.3.2 电镜前处理
    根据生长曲线图,在BHI和BHI+0.5%mucin液体培养基中再进行一批菌培养,分别在其对数期和稳定期进入如下操作:将培养到相应时期的菌液转移到10ml离心管中,12000rpm离心3min,小心弃去上清液收集菌体沉淀。用1ml 1×PBS悬浮菌体细胞,吹吸几次彻底混匀,12000rpm离心1min,弃置上清液,重复该步骤两次以彻底漂洗菌体细胞,随后用100μl 1×PBS缓冲液悬浮并转移到2ml 2.5%戊二醛固定液中,放置在4℃冰箱中过夜,送样。
1.4 细菌DNA提取
依据绘制的生长曲线图分析明确A. muciniphila的生长规律,重新培养一批菌,等到OD600达到0.14左右时,再按照天根提供的细菌基因组DNA提取试剂盒上的步骤进行如下操作:
①按照每管6ml的量取达到相应OD值的AKK菌液到10ml离心管中,共10管,12000rpm离心3min,小心倾倒上清液收集菌体细胞。然后用移液枪吸取200μl GA缓冲液重悬菌体沉淀,接着往上述重悬液中添加20μl Proteinase K溶液,颠倒混合后加入220μl GB缓冲液,涡旋振荡仪作用15s,70℃金属浴10min,直至溶液变澄清透明。最后加入220μl无水乙醇,涡旋振荡仪15s,会出现部分不溶絮状物。
②将上述的整个反应体系用移液枪转移到套有2ml无菌收集管的吸附柱CB3中,12000rpm离心30s,倒掉收集管中的废液后再次将吸附柱插回。沿壁向吸附柱中添加500μl GD缓冲液,12000rpm离心30s,倒废液后将吸附柱放回收集管。
③用移液枪沿壁向CB3柱中添加600μl漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉收集管中的废液后再次将吸附柱插回,重复漂洗一次。然后将空柱12000rpm离心2min后开盖干晾以彻底除去柱子中的漂洗液,以免影响后续实验的进行。 肠道微生物Akkermansia muciniphila的功能基因研究(3):http://www.lwfree.cn/shiping/20181023/24764.html
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